Phân lập các chất từ phân đoạn nước của lá cây Ráng đại

CHƯƠNG II : PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

2.2 Thực nghiệm

2.2.4 Phân lập các chất từ phân đoạn nước của lá cây Ráng đại

Sắc ký cột sử dụng cột thủy tinh có đường kính 3 cm, dài 80 cm với chất hấp phụ là Diaion HP-20.

Hịa tan hồn tồn 135.8 g cao chiết phân đoạn nước với lượng nước cất tối thiểu và được đưa lên cột Diaion HP20. Cột được rửa giải bằng nước cất để loại muối và đường tự do. Sau đó tiếp tục rửa giải bằng hệ dung mơi W/M với lượng MeOH tăng dần từ 20, 40, 80 và 100 % thu được 4 phân đoạn ký hiệu từ W1 đến W4.

Phân đoạn W1 thu được khi rửa giải bằng dung môi MeOH 20 % (21.6 g) được tiếp tục phân tách bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải là D/M = 10/1, 5/1, 2.5/1, 1/1. Hứng các phân đoạn vào các ống nghiệm 20 ml, theo dõi quá trình rửa giải bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) với các hệ dung mơi thích hợp. Các ống nghiệm hiện vết giống nhau trên sắc ký lớp mỏng gộp lại thành phân đoạn lớn, cô quay loại dung môi thu được 5 phân đoạn tập hợp (F1 đến F5).

3.2 kg bột lá Ráng đại

– Ngâm chiết siêu âm 5 lần trong MeOH

– Lọc

– Cô quay giảm áp

1.5 lít dịch chiết MeOH

Chiết với n-Hexan

Chiết với EtOAc

Cao chiết nước (WA) (135.8 g )

Cao chiết n-Hexan (87.2 g)

Cao chiết EtOAc (61.0 g)

2. Bổ sung 1.5L H2O 1. Cô quay loại MeOH

Trang 20

Tại hệ dung môi rửa giải D/M = 10/1 thu được phân đoạn F2. Tiến hành cô quay loại dung môi rồi phân tách phân đoạn F2 bằng sắc ký cột sephadex LH-20 với dung môi rửa giải là MeOH, ta thu được 3 phân đoạn nhỏ là F2.1, F2.2 và F2.3. Tiến hành tinh chế hai phân đoạn F2.2 bằng sắc ký cột silica gel pha đảo RP-18 với hệ dung

Tham khảo  ✴️ Vị thuốc Găng vàng

môi rửa giải là W/A = 3/1 thu được hợp chất ký hiệu WA18 (2.1 mg). Tinh chế phân đoạn F2.3 bằng sắc ký cột silica gel pha đảo RP-18 với hệ dung môi rửa giải là W/M = 2.5/1 thu được lần lượt ba hợp chất ký hiệu là WA2 (33.2 mg), WA3 (41.1 mg) và

WA4 (67.6 mg).

Tại hệ dung môi rửa giải D/M = 5/1 thu được phân đoạn F3. Tiến hành cô quay loại dung môi rồi tinh chế phân đoạn F3 bằng sắc ký cột silica gel pha đảo RP-18 với hệ dung môi rửa giải là W/M = 3/1 thu được một hợp chất ký hiệu là WA6 (26.5 mg).

Trang 21

a. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của hợp chất WA2: 4-(3ʹ -O-sulfate-4ʹ – hydroxyphenyl)-2-butanone (chất mới)

Hợp chất WA2 thu được từ phân đoạn chiết nước của lá cây Ráng đại ở dạng bột, màu trắng.

Khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS: m/z = 259.0291 [M-H]– (khối lượng tính tốn 259.0282, C10H11O6S) Phổ hồng ngoại IR (KBr): max 3388, 2914, 2848, 1728, 1658, 1467, 1178, 1024, 993, 825, 761 cm-1 Sephadex (CC) MeOH F2.1 F2.2 F2.3 RP18_C18 (CC) W/A = 3/1 WA18 (2.1 mg) (4.8mg) RP18_C18 (CC) W/M = 2.5/1

WA2 (33.2 mg) WA3 (41.1 mg) WA4 (67.6 mg) F3 (1.2 g)

WA6 (26.5 mg)

(4.8mg)

135.8 g phân đoạn nước lá AA

W1 (21.6 g) W4 Diaion (CC) W/M: 0, 20, 40, 80, 100% MeOH 20% MeOH Silica gel (CC) D/M: 10/1, 5/1, 2.5/1, 1/1 F1 (1.2 g) F2 (4.3 g) F5 … RP 18 _C18 (CC) W/M = 3/1 …

Trang 22

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H NMR (500MHz, DMSO-d6) δH (ppm): 8.67 (1H,

s, 4’- OH), 6.92 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2’), 6.77 (1H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz, H-6’), 6.70

(1H, d, J = 8.5 Hz, H-5’), 2.70 (2H, m, H-3), 2.64 (2H, m, H-4), 2.07 (3H, s, H-1). Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C NMR (125MHz, DMSO-d6) δC (ppm): 207.7 (C- 2), 147.2 (C-4’), 140.5 (C-3’), 132.1 (C1’), 124.5 (C-6’), 122.8 (C-2’), 117.0 (C-5’), 44.3 (C-3), 29.1 (C-1), 28.1 (C-4),

b. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của hợp chất WA3: 4-(3ʹ -O-sulfate-4ʹ –

Tham khảo  Nguyệt quới

hydroxyphenyl)- 2(R)-butanol (chất mới)

Hợp chất WA3 thu được ở dạng bột, màu trắng. Góc quay cực riêng [𝛼]𝐷25 = -28.6 (c, 0.1, MeOH)

Phổ hồng ngoại IR (KBr): max 3383, 2914, 2848, 1643, 1512, 1269, 1024, 993, 825, 761 cm-1

Khổi phổ phân giải cao HR-ESI-MS: m/z = 261.0446 [M-H]– (khối lượng tính tốn 261.0448, C10H13O6S)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H NMR (500MHz, DMSO-d6) δH (ppm): 8.61 (1H,

s, 4’- OH), 6.91 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2’), 6.76 (1H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz, H-6’), 6.70

(1H, d, J = 8.5 Hz, H-5’), 4.42 (1H, d, J = 4.5 Hz, 2-OH), 3.57 (1H, quint, H-2), 2.50

(1H, m, H-4), 2.43 (1H, m, H-4), 1.54 (2H, m, H-3), 1.06 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-1). Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C NMR (125MHz, DMSO-d6 ) δC (ppm): 146.9 (C- 4’), 140.5 (C-3’), 133.4 (C-1’), 124.5 (C-6’), 122.8 (C-2’), 116.9 (C-5’), 65.2 (C-2), 41.0 (C-3), 30.6 (C-4), 23.5 (C-1).

c. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của hợp chất WA6: dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 9-O-sulfate (chất mới)

Hợp chất WA6 thu được ở dạng bột, màu trắng. Góc quay cực riêng [𝛼]𝐷25 = 0 (c, 0.1, MeOH)

Phổ hồng ngoại IR (KBr): max 3358, 2939, 2839, 1604, 1531, 1492, 1384, 1249, 1195, 1128, 1062, 985, 815 cm-1

Khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS: m/z =439.1074 [M-H]- (khối lượng tính tốn 439.1068, C20H23O9S)

Trang 23

Phổ CD (MeOH, c 3.8 × 10-4 M) mdeg (λmax): +0.92 (204 nm), +0.55 (224 nm), +0.23 (242 nm), +0.26 (290 nm)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H NMR (500MHz, CD3OD) δH (ppm): 7.03 (1H, d,

J = 2.0, H-2), 6.89 (1H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz, H-6), 6.79 (1H, s, H-6’), 6.77 (1H, d, J =

8.0 Hz, H-5), 6.75 (1H, s, H-2’), 5.60 (1H, d, J = 6 Hz, H-7), 4.30 (1H, dd, J = 6.0, 10.5,

H-9a), 4.19 (1H, dd, J = 8.0, 10.5, H-9b), 3.88 (3H, s, 3’-OCH3), 3.85 (3H, s,

3-OCH3), 3.70 (1H, m, H-8), 3.58 (2H, t, J = 6.5, H-9’), 2.64 (2H, t, J = 7.5, H-7’),

1.84 (2H, m, H-8’)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C NMR (125MHz, CD3OD) δC (ppm): 149.0 (C-3), 147.6 (C-4’), 147.3 (C-4), 145.2 (C-3’), 137.1 (C1’), 134.4 (C-1), 128.8 (C-5’), 119.4 (C-6), 118.1 (C-6’), 116.1(C-5), 114.4 (C-2’), 110.6 (C-2), 88.8 (C-7), 70.0 (C-9), 62.2 (C-9’), 56.8 (3’-OCH3), 56.4 (3-OCH3), 52.8 (C-8), 35.7 (C-8’), 32.8 (C-7’).

Tham khảo  Bào chế đông dược: Cửu chưng cửu sái là gì?

d. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của hợp chất WA18: dihydrodehydrodiconiferyl alcohol-4-O-glucoside

Hợp chất WA6 thu được ở dạng bột, màu trắng.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H NMR (500MHz, CD3OD) δH (ppm): 7.17 (1H,

d, J = 8.0 Hz, H-5), 7.05 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2), 6.96 (1H, dd, J = 2.0, 8.0 Hz, H-

6), 6.75 (1H, s, H-2ʹ), 6.73 (1H, s, H-6ʹ), 5.58 (1H, d, J = 6.0 Hz, H-7), 4.85 (1H, m,

H-1ʹʹ ), 3.88 (3H, s, 3-OCH3), 3.86 (2H, m, H-6ʹʹa, H-9a), 3.85 (3H, s, 3ʹ-OCH3), 3.76 (1H, m, H-9b), 3.69 (1H, m, H-6ʹʹb), 3.60 (2H, t, J = 6.5 Hz, H2-9ʹ), 3.50 (1H, m, H-

8), 3.41-3.47 (4H, m), 2.64 (2H, t, J = 7.5 Hz, H2-7ʹ), 1.83 (2H, m, H2-8ʹ).

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C NMR (125MHz, CD3OD) δC (ppm): 151.0 (C-3), 147.6 (C-4), 147.5 (C-4’), 145.2 (C-3’), 138.5 (C-1), 137.1 (C-1’), 129.6 (C-5’), 119.4 (C-6), 118.1 (C-5), 117.9 (C-6’), 114.2 (C-2’), 111.2 (C-2), 102.8 (C-1”), 88.4 (C-7), 78.2 (C-3”), 77.8 (C-5”), 74.9 (C-2”), 71.3 (C-4”), 65.1 (C-9), 62.5 (C-6”), 62.2 (C-9’), 56.8 (3-OCH3), 56.7 (3’-OCH3), 55.6 (C-8), 35.8 (C-8’), 32.9 (C-7’).

e. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của hợp chất WA4: (+)-pinoresinol-4-O-sulfate

Hợp chất WA4 thu được ở dạng bột, màu trắng.

Trang 24

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H NMR (500MHz, DMSO-d6) δH (ppm): 8.87 (1H,

s, 4-OH), 7.40 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5), 6.92 (1H, d, J = 1.5 Hz, H-2), 6.89 (1H, d, J

= 1.5 Hz, H-2ʹ), 6.82 (1H, dd, J = 1.5, 8.0 Hz, H-6), 6.76 (1H, dd, J = 1.5, 8.0 Hz, H-

6ʹ), 6.72 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5ʹ), 4.67 (1H, d, J = 4.5 Hz, H-7), 4.60 (1H, d, J = 4.5

Hz, H-7ʹ), 4.14 (2H, m, H-9a, H-9ʹa), 3.76 (3H, s, 3ʹ-OCH3), 3.75 (2H, m, H-9b, H-

9ʹb), 3.74 (3H, s, 3-OCH3), 3.05 (2H, m, H-8, H-8ʹ)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C NMR (125MHz, DMSO-d6 ) δC (ppm): 150.4 (C-3), 147.5 (C-3’), 145.8 (C-4’), 141.9 (C-4), 136.5 (C-1), 132.1 (C-1’), 120.7 (C- 5), 118.6 (C-6’), 117.5 (C-6), 115.1 (C-5’), 110.5 (C-2), 110.4 (C-2’), 85.2 (C-7’), 84.9 (C-7), 71.0 (C-9), 70.9 (C-9’), 55.6 (3’-OCH3), 55.5 (3-OCH3), 53.7 (C-8), 53.5 (C-8’).